Sistemul CRISPR-CAS9 a reușit să fie fotografiat în acțiune • Anastasia Pashutova • Stiri despre "Elemente" • Biologie moleculară, genetică

Sistemul CRISPR-CAS9 a reușit să tragă în acțiune

Fig. 1. Mecanismul sistemului Crispr-Cas. 1 – segmentul ADN al virusului pe care celulă la întâlnit prima dată (roșu) este inserat în locusul CRISPR, unde segmentele ADN ale virușilor pe care le-a întâlnit anterior au fost deja stocate (săgeți colorate). 2 – pe baza bibliotecii CRISPR, se creează ghiduri ARN, care formează un complex cu proteina Cas (ovale purpurii). 3 – Când complexul Cas-ARN întâlnește ADN viral (verde), complementar ARN-ului ghid, se conectează cu el și distruge, tăind în bucăți. Imagine de la gesundheitsindustrie-bw.de

În ciuda istoriei deja mai mult de zece ani de studiu al sistemului CRISPR-Cas și de aplicare a acestuia la editarea genomului, până acum nimeni nu a văzut-o la lucru. Oamenii de știință japonezi au eliminat acest decalaj și au fost primii din lume care au obținut un videoclip despre acest proces utilizând un microscop cu forță atomică de mare viteză. Sa dovedit că elementele sistemului se leagă de moleculele ADN într-un mod diferit decât se credea anterior: nu se târăsc de-a lungul acestor molecule în căutarea locului potrivit, ci o găsesc folosind difuzia tridimensională.

Sistemul CRISPR-Cas9, folosit pentru editarea bazată pe genom, a câștigat o mare popularitate în rândul oamenilor de știință.Numărul de articole care menționează acest sistem crește în fiecare an (începând cu mai multe articole în 2011 și terminând cu mai mult de două mii de articole în 2017).

Reamintim că CRISPR-Cas este sistemul imunitar al bacteriilor. La fel ca sistemul nostru imunitar, care are:
1) celulele de memorie, sarcina căreia este să-și amintească "dușmanul" în față și să salveze informații despre el (de exemplu, o populație de limfocite speciale stochează informații despre o armă folosită anterior împotriva agentului infecțios și formează un răspuns imun secundar);
2) celule care vor lupta direct împotriva inamicului (de exemplu, T-ucigași);
bacteriile au, de asemenea, un mecanism care vizează eliminarea agenților infecțioși. Numai în bacterii, celulele individuale nu sunt responsabile pentru imunitate, ci pentru acizi nucleici (ADN și ARN) și proteine ​​special adaptate în acest scop. CRISPR (grupate repetat repetate palindromice interspaced), un complex de segmente ADN repetitive, stă la baza sistemului imunitar bacterian. Între ele există distanțiere – separatoare cu fragmente genomice de virusuri – "portrete" genetice ale celor cu care această bacterie a întâlnit deja. Aceasta este o bază specială de identificări ale violatorilor din genomul bacteriei.

Funcționează așa.Dacă un virus pe care nu l-a văzut înainte și a reușit să-l lupte, a intrat în bacterie, atunci va lăsa în memorie o mică bucată de ADN viral, care va fi stocată în locația CRISPR (figura 1). După aceea, este necesar să se traducă secvența nucleotidică obținută de la virus într-o formă capabilă să vizeze proteinele Cas. Pentru aceasta, este creat un așa-numit ARN de ghidare (gARN), care repetă bucata de ADN viral inserat în bază. De regulă, ghidurile de ARN sunt create în mod constant și la o viteză destul de scăzută, dar când o celulă se ciocnește cu un virus sau în condiții de stres, viteza crește semnificativ. După crearea ARN, se leagă de complexul de proteină Cas. Acum, complexul Cas-gARN, ca un polițist cu identitatea unui criminal, poate patrula o celulă. Când se găsește o bucată de ADN străin care este complementară ARN-ului de ghidare, complexul se leagă de această piesă, iar proteinele Cas o desfac ca o pereche de foarfece moleculare. Pentru mai multe informații despre acest mecanism molecular, vedeți, de exemplu, articolul lui D. E. Dzhagarov, Foarfecă inteligentă pentru ADN.

Descoperit cu aproape 30 de ani în urmă, de peste 20 de ani, acest sistem a fost de interes numai pentru biologi moleculari care încercau să înțeleagă proprietățile acestui mecanism unic de protecție.În 2012, potențialul sistemelor CRISPR-Cas9 a fost identificat ca un instrument pentru editarea genomului care poate iniția modificări genetice vizate în aproape orice organism. În anii următori, folosind această metodă, oamenii de știință au reușit să elimine, de exemplu, șoarecii de boli genetice (JR Mendell, LR Rodino-Klapac, 2016. distrofia musculară Duchenne: tratament CRISPR / Cas9), pentru a vindeca animalele de la HIV (C. Yin și colab. 2017. Exprimarea in vivo a ARN-urilor cu un singur ghid în modelele animale și chiar editarea genomului embrionului și a adulților (vezi P. Liang și colab., 2015. Editarea genetică mediată de CRISPR / Cas9 în zygote tripronucleare umane și note populare D. Cyranoski oameni de știință chinezi de a pionier prima încercare umană CRISPR). Citiți despre istoricul și rezultatele principale ale aplicării acestei metode în știri. Rezultatele primului deceniu al studiului CRISPR au fost rezumate ("Elements", 13.07.2017).

În ciuda progreselor semnificative, până în prezent nu a existat o singură observație directă a funcționării acestui sistem. Acest gol a fost eliminat de un grup de oameni de știință japonezi condus de Mikihiro Shibata (Mikihiro Shibata), folosind un microscop cu forță atomică de mare viteză (HS-AFM), care permite molecule de imagistică și chiar atomi individuali. Articol despre studiul publicat în jurnal Comunicații naturale.

Cu ajutorul imaginilor HS-AFM, dinamica proteinelor poate fi identificată cu detalii fantastice.De exemplu, oamenii de știință anteriori, printre care au fost câțiva dintre autorii lucrării aflate în discuție, au reușit să surprindă modificări conformaționale fotoinducte în molecula bacorhodopsidină (M. Shibata și colab., 2010, microscopia moleculei atomice și să observe molecula). miozina, mersul printr-un filament de actina (N. Kodera et al., 2010. Microscopie cu forta atomica de mare viteza).

Principiul funcționării unui microscop de forță atomică se bazează pe interacțiunea intermoleculară dintre suprafața probei și sonda. Sonda este o margine nanometrică care se află la capătul unui consolă elastică. Suprafața scanată poate atrage sau respinge sonda, ceea ce face ca cantileverul să se îndoaie (figura 2). Această curbă este înregistrată cu ajutorul unui laser, care, reflectat dintr-un consola, lovește un detector foto sensibil (pentru detalii, vedeți articolul lui A. Kuramshin. Uită-te la atomi, atingeți molecula). Microscopia de forță atomică de mare viteză funcționează pe același principiu. Singura diferență este că se folosește consola, care este de mii de ori mai mică decât cea folosită în clasicul AFM, ceea ce permite creșterea vitezei de achiziție a imaginii.

Fig. 2. Schema microscopului forței atomice. Imagine de la simple.wikipedia.org

Oamenii de știință înșiși au pregătit moleculele necesare pentru studiu. Proteina Cas9 s-a sintetizat în celule E. coli. E. coliși apoi a fost purificat prin cromatografie pe coloană. ARN-țintă și ADN țintă sintetizate in vitro. În plus, a fost preparat un substrat special pe care au fost plasate ulterior biopolimeri. Următoarele cerințe sunt prezentate pentru substraturile utilizate pentru AFM: suprafața trebuie să fie suficient de netedă și să admire obiectele studiate. La scanarea biomoleculelor se utilizează cel mai adesea substraturi mica. Și, deși astfel de substraturi au o suprafață hidrofilă cu porțiuni atomice mai mari de 100 microni, au mai multe dezavantaje – de exemplu, încărcarea negativă a suprafeței (care poate interfera cu ADN-ul, deoarece grupările fosfatice au de asemenea o sarcină negativă) și capacitatea de a suprima difuzia liberă complecși. Pentru a depăși aceste neajunsuri, cercetătorii au modificat suprafața mica în două moduri diferite:
1) a tratat suprafața micii cu o soluție de APTES ((3-aminopropil) trietoxisilan), ca rezultat al formării unei pelicule pe suprafața micii, care are o încărcătură pozitivă în apă.
2) a fost formată o bilatiere lipidică pe suprafața mica, datorită căreia interacțiunile dintre complexul de CasA-ARN și mica au fost minimizate.

Primul lucru pe care oamenii de stiinta japonezi l-au facut a fost sa incerce sa fotografieze proteina Cas9 fara a directiona ARN-ul. Anterior, modificările în proteina Cas9 care au apărut în timpul funcționării sale au fost studiate utilizând analiza de difracție cu raze X (PCA). Această metodă permite obținerea unei structuri tridimensionale a unei molecule, de exemplu, o proteină (vezi A. Oganov, 10 fapte despre cristalografie). Pe scurt, procesul de obținere a imaginii prin această metodă constă în următoarele etape: realizarea unei soluții sintetice de proteine ​​care a fost supusă purificării, procesul de cristalizare a probei, colectarea datelor de dispersie a razelor X și prelucrarea directă a datelor, inclusiv simulările pe calculator.

Studiile anterioare au arătat că molecula Cas9 într-o stare liberă are o structură rigidă. Pentru a testa acest lucru, oamenii de stiinta japonezi au luat modele de cristal obtinute de un alt grup de cercetatori si le-au comparat cu imaginile lor obtinute pe AFM. Sa constatat că proteina liberă are o structură mobilă diferită de structura rigidă observată în cristal (fig.3, b, c).Adică datele obținute anterior cu ajutorul XRD s-au dovedit a fi irelevante, deoarece nu corespund structurii proteinei în stare naturală.

Fig. 3. b– Structuri de cristale, de la stânga la dreapta: un singur Cas9, un complex Cas9-ARN, Cas9-ARN, legat de un ADN țintă monocatenar, și ARN-ul Cas9, legat de țintă (ADN dublu catenar). Culori diferite domeniile funcționale desemnate ale proteinei: un pahar alb – lama alfa-spirală, rozul – domeniul nucleaza al HNH, care scindează ADN țintă, albastru – domeniul nucleaza al lui RuvC, care desprinde un lanț de ADN nedirijat, bej – domeniul PAM care recunoaște o piesă specială de ADN țintă; c și d – imagini secvențiale obținute cu un microscop cu forță atomică de mare viteză: unic Cas9 (c) și complexul Cas9-ARN ( d ). A fost indicată o coadă mică o săgeată, aceasta este o bucată de ARN care iese din lobul alfa-elicoidal. Cântare în dreapta arată înălțimea obiectului deasupra substratului. Imagine din articol în discuție Comunicații naturale

Apoi cercetatorii au filmat complexul Cas9 cu ghidul ARN. Spre deosebire de o singură proteină, complexul Cas9-ARN a avut o arhitectură stabilă cu biloba corespunzătoare structurii cristaline (Fig.3, b, d, vezide asemenea, numărul 2 din materiale suplimentare la articolul în discuție).

Următoarea etapă a fost vizualizarea legării complexului Cas9-ARN la ADN-ul țintă. În primul rând, toți "participanții" au fost adsorbiți pe suprafața substratului: complexe moleculare ale ARN-ului Cas9 și ADN țintă. În cadrul videoclipului, puteți observa că complexul Cas9-ARN se leagă în mod specific de obiectivul său de ADN. Toate acestea s-au efectuat în absența ionilor de magneziu Mg2+. Ioniile acestui metal sunt necesare pentru funcționarea adecvată a nucleazelor, prin urmare complexul se leagă de ADN fără magneziu, dar nu are loc nici o divizare suplimentară (Figura 4, vezi și numărul 3 din materiale suplimentare pentru articolul în discuție).

Fig. 4. Complexul Cas9-ARN, în mod specific (adică, într-o locație specifică în care va avea loc tăierea) asociată cu țintă în absența ionilor Mg2+, nu taie ADN-ul. Imagine din articol în discuție Comunicații naturale

Pentru a vizualiza procesul de spargere a ADN-ului, cercetatorii au repetat pasul anterior, dar au adaugat deja magneziu. Apoi, proteina Cas9 a reușit să taie ADN-ul. Videoclipul arată cum, după inserarea pauzelor duble, o parte a ADN-ului este eliberată din complex (fig.5 și video).

Fig. 5. Complexul Cas9-ARN în prezența ionilor Mg2+ taie ADN-ul. Săgeți albe și roz indică domeniul nucleat al NHN într-o stare inactivă și activă. Se arată sfârșitul eliberat al catenei ADN. albastru săgeată pe ultimul cadru. Imagine din articol în discuție Comunicații naturale

Complexul Cas9-ARN taie molecula de ADN

Din cauza lipsei de rezoluție a imaginii, din păcate, rămâne necunoscut cum se eliberează partea rămasă din molecula ADN din complex.

Oamenii de știință sunt de asemenea capabili să combată teoria că modul în care complexul Cas9-ARN se leagă la locația dorită de pe molecula de ADN: anterior sa crezut ca proteina asociată cu ARN, „slide-uri“ asupra ADN-ului complementar în căutarea terenurilor. În acest scop, cercetătorii au folosit un substrat bazat pe bilipid pentru a minimiza interacțiunea dintre mica și proteină, care poate interfera cu difuzia liberă a complexului. Sa dovedit că Cas9 fără un ARN de ghidare se leagă de molecula ADN și doar alunecă de-a lungul acestuia. Dar când proteina are un ARN complementar la locația dorită, complexul nu aluneca si comunica direct cu ținta (Fig. 6. A se vedea de asemenea, video №7 de materiale adiționale la documentul de discuție). Aparent, prezența ARN-ului de ghidare împiedică complexul de Cas7-ARN să "pătrundă" ADN-ul pentru a aluneca de-a lungul acestuia.Deci, legarea se produce datorită difuziei tridimensionale: complecșii plutesc în soluție și dacă sunt norocoși să fie aproape de segmentul ADN dorit, se leagă de ea.

Fig. 6. o – câteva proteine ​​Cas9 (marcate săgeată), care lipsesc ARN-ul directoare, alunecă de-a lungul moleculei ADN-ului. b – complexul Cas9-ARN se leagă imediat de locul dorit, de îndată ce se află lângă el datorită difuziei tridimensionale. În cel de-al doilea cadru, se observă mai multe molecule de ADN, dintre care unul este așezat deja de complexul de Cas7-ARN (săgeată de jos), iar pe de altă parte există un loc pe care un alt complex îl va contacta ulterior (săgeată sus). În cel de-al patrulea și al cincilea cadru, se vede clar că ARN-ul Cas9 apare imediat și nu se aliniază de-a lungul ADN-ului. Imagine din articol în discuție Comunicații naturale

Aceste videoclipuri granulate și aparent stânjenite îi fac pe oamenii de știință din întreaga lume să se uite cu bucurie. Pe de o parte, sistemul CRISPR-Cas9 funcționează așa cum a fost anticipat mai devreme. Pe de altă parte, au apărut deja noi detalii în legătură cu modul în care complexul proteic se leagă de segmentul corect de ADN. În general, acest studiu oferă detalii fără precedent despre dinamica funcțională a CRISPR-Cas9 și subliniază potențialulde microscopie de forță atomică de mare viteză pentru a determina mecanismele de acțiune ale moleculelor asociate cu acizii nucleici.

Sursa: Mikihiro Shibata, Hiroshi Nishimasu, Noriyuki Kodera, Seiichi Hirano, Toshio Ando, ​​Takayuki Uchihashi și Osamu Nureki. CRISPR-Cas9 dinamica real-spatiala in timp real a microscopiei vizualizate de forta atomica de mare viteza // Comunicații naturale. 2017. DOI: 10.1038 / s41467-017-01466-8.

Anastasia Pashutova


Like this post? Please share to your friends:
Lasă un răspuns

;-) :| :x :twisted: :smile: :shock: :sad: :roll: :razz: :oops: :o :mrgreen: :lol: :idea: :grin: :evil: :cry: :cool: :arrow: :???: :?: :!: