CRISPR: Bătălia Titanilor și Noua Speranță

CRISPR: Bătălia Titanilor și Noua Speranță

Elena Kleshchenko
"Chimia și viața" №7, 2018

Litigiul privind prioritatea în utilizarea tehnologiilor CRISPR pentru editarea genomilor animalelor de sus continuă și dispare. Dar genomul de editare este departe de singura direcție promițătoare.

Sistemul CRISPR-Cas9 de "imunitate" bacteriană și utilizarea acestuia pentru editarea genomului "Chimie și Viață" scrie constant. (Nu vom da jumătate de duzină de referințe, cei care doresc pot folosi căutarea cuvântului "CRISPR" în arhiva revistei.) Deschidere; încântați de natura viclenia și noile posibilități fantastice ale biotehnologiei. Încercările de a edita genomul uman, apoi realizarea faptului că nu totul este atât de simplu și nu este bine mâine; totuși, aplicațiile medicale mai modeste și practice, cum ar fi editarea celulelor sistemului imunitar uman pentru combaterea cancerului, se dezvoltă cu succes. O revoluție în metodele experimentale. În sfârșit, marea bătălie dintre avocații de la Institutul Brod și Universitatea din California din Berkeley, care susține prioritățile Feng Zhang și Jennifer Dudna, respectiv. (Emmanuel Charpentiere, coautor european al lui Dudna, refuză să discute despre războiul american de brevete.) Acum, în istoria CRISPR, sunt prezentate contururi noi de intrigă.

Scurt cronologie

Octombrie 2017. Angajații Institutului Brod au propus modificări interesante ale editării CRISPR – corectarea "literelor" individuale ale ADN sau ARN fără tăierea moleculei.

15 februarie 2018. În aceeași cameră știință – două articole ale unor figuri de vârf ale tehnologiilor CRISPR (principalul autor este unul Dudna, celălalt este Zhang), oferind instrumente de diagnostic bazate pe CRISPR, surprinzător de asemănătoare ideologic. O selecție similară despre aceleași tehnologii a apărut în această problemă. știință pe 27 aprilie.

26 aprilie. Pornirea a început Mammoth Biosciences, unul dintre co-fondatori este Jennifer Dudna. Scopul declarat este crearea unor sisteme de testare CRISPR puternice, convenabile și ieftine, fără precedent, pentru nevoile medicinii, ingineriei agricole și științelor criminalistice.

27 aprilie. Institutul Brod Biotech Startup Lansat – Beam Therapeutics. Scopul este de a utiliza CRISPR pentru medicina genetică de precizie. Co-fondatorii includ David Liu și Feng Zhang.

30 mai. O altă rundă de luptă legală între Universitatea din California și Institutul Wade. Curtea federală de apel american a auzit un mesaj de la un avocat al Universității din California, potrivit căruia oficiul de brevete a făcut o greșeală, concluzionând că ideea lui Feng Zhang și a co-autorilor săi de a utiliza CRISPR pentru a edita genomul mamiferelor ar putea fi un motiv pentru a le acorda prioritate.

31 mai. Academia Norvegiană de Științe a numit laureații Premiului Kavli; Emmanuel Charpentier, Jennifer Dudna și Virginijus Šikšnys de la Universitatea din Vilnius au câștigat premiul pentru nano-știință. N-ai auzit numele de familie? Nu sunteți singuri.

Alternativă la Premiul Nobel. Sau o repetiție?

Premiul Kavli este acordat la fiecare doi ani pentru realizări remarcabile în domeniul astrofizicii, nanotehnologiei și neuroștiinței. A fost fondată în 2007 de Fred Kavli, un filantrop american de origine norvegiană, care a făcut o avere pe senzorii senzori pentru aviație. Kavli a visat să creeze o alternativă la Premiul Nobel – el, în opinia sa, este prea conservator și lent, adesea pensionarul nu primește recunoașterea realizărilor științifice. Co-fondatorii sunt Academia de Științe din Norvegia și Ministerul Norvegian al Educației și Cercetării. Alegerea nominalizărilor Kavli a explicat după cum urmează: "Am decis să susțin trei domenii ale științei: unul se ocupă cu cel mai mare, celălalt cu cel mai mic și cel de-al treilea cu cel mai dificil".

Premiul pentru Nanotehnologia Kavli din 2018 pentru invenția CRISPR-Cas9 – un instrument precis de nano-instrumentare pentru editarea ADN-ului, care a realizat un progres în domeniul biologiei,Emmanuel Charpentier (acum lucreaza la Institutul de Biologie Infectioasa a Societatii Max Planck din Germania) si Jennifer Dudna (Universitatea din California, Berkeley, SUA), precum si Virginius Shikshnis de la Universitatea din Vilnius. ), medaliile și diplomele vor fi acordate câștigătorilor din Oslo pe 4 septembrie.

Descoperirea sistemului CRISPR-Cas9 și crearea de instrumente pentru editarea genomului este meritul a zeci de oameni de știință. Detalii pot fi găsite în eseul "Heroes of CRISPR" de către directorul Institutului Ford, Eric Lander (celulă, 2016, 164 (1), pag. 18-28, text integral, a se vedea și reluarea rusă pe site-ul "Biomolecule"); printre eroii pe care îi știm sunt Evgeny Kunin și Konstantin Severinov împreună cu colegii. Dar premiul principal – o prioritate în aplicații practice – ar putea obține doar câteva.

În august 2012, echipa de autori sub conducerea Charpentier și Dudny a raportat despre utilizarea sistemului CRISPR-Cas9 pentru editarea genomului (știință, 2012, V. 337, 6096, p. 816-821). Iar la o lună mai târziu, în luna septembrie a aceluiași an, grupul condus de Shikshnis (PNAS, 2012, 109 (39), E2579-E2586, text integral). Vilnienii au fost al doilea fără vina proprie, mai devreme în 2012 au trimis un articol pe aceeași temă în celulă, dar articolul a fost respins fără o atenție deosebită: un jurnal mare, oameni de știință dintr-o țară mică … Și au început să lucreze la CRISPR nu mai târziu de 2007, în special, aceștia transferau sistemul de streptococi CRISPR către E. coli. Primul autor al articolului din PNAS, Gedryus Gasiunas, în 2016, la întrebarea corespondentului natură dacă rolul unui erou nevărsat îl deranjează puternic, el a răspuns filosofic: "Știința este un domeniu de activitate riscant, dar dacă vrei să realizi ceva, trebuie să risci".

De fapt, totul nu este atât de rău: comunitatea științifică își amintește meritele, premiul acordat lui Shikshnis a fost primit pozitiv de Premiul Kavli, iar înainte de aceasta au mai fost și alte premii – de exemplu, în 2017, Shikshnis și Charpentier au primit premiul danez Novo Nordisk fond Novozymes 3 milioane coroane daneze (403.000 de euro). Dar mass-media în subtilitățile politicii de publicare de reviste științifice nu se potrivesc, acestea sunt în situația actuală sunt mult mai atras de două femei inteligente și frumoase, blonda Jennifer și bruneta Emmanuel. (Nu vreau să mă gândesc, dar amândoi ar fi arătat grozav în Sala Albastră a Primăriei din Stockholm și ar fi disprețuit în chip strălucitor toate aceste insinuări cu privire la atribuirea medaliilor Nobel numai bătrânilor respectabili!)

Și ce zici de Feng Zhang de la Institutul Brod, care de obicei se referea la Dudna și Charpentier, dar a fost ocolit de comitetul de organizare al Premiului Kavli? Grupul, condus de Feng Zhang, a fost publicat mai târziu – în februarie 2013 (știință, 2013, 1231143). Dar în munca lor, tehnologia a fost testată pe celulele de mamifere – umane și mouse-ul, care ulterior sa dovedit a fi cheia brevetării.

Care prioritate?

Amintiți-vă că, în aprilie 2014, Institutul Brod a primit primul dintre mai multe brevete privind utilizarea CRISPR în celulele de mamifere. (Zhang a depus cererea de brevet mai târziu la Dudna, în decembrie 2012, dar Institutul Brod a solicitat o revizuire expediată de către Oficiul pentru Brevete și Mărci din SUA, plătindu-i o sumă mică și limitând domeniul de aplicare al brevetului la eucariote.) Avocații Universității din California au contestat această decizie, În 2017, Consiliul pentru instanțe de brevete și contestații a decis în favoarea Institutului Brod. acțiuni Editas Medicine, unul dintre co-fondatori – Feng Zhang, imediat a crescut în preț – a fost clar că această companie particulară ar obține o licență. (Apropo, Dudna a fost și co-fondator Editas – la acel moment nimeni nu a fost de gând să lupte, – dar a lăsat-o după începerea litigiului de litigiu "din motive familiale" și a fondat compania Terapia intellia.) La puțin timp după aceea, când Zhang a vorbit la Universitatea din California, administrația a luat măsuri pentru ca studenții să nu-și exprime nemulțumirea oaspeților: brevetele sunt brevete, iar normele de comportament în comunitatea academică sunt sacre.

Și în mai 2018, un avocat care a reprezentat interesele Universității din California a anunțat că Consiliul a făcut o "greșeală juridică" în interpretarea conceptului de "neevidență" și a solicitat instanței de apel să anuleze decizia Consiliului sau să o returneze pentru revizuire. Soluțiile în astfel de cazuri trebuie de obicei să aștepte câteva luni.

Ce fel de "non-evidentitate"? Universitatea din California susține că o încercare de a aplica CRISPR în celulele de mamifere a fost o idee evidentă. S-ar fi putut întâmpla, nu s-ar fi putut întâmpla, dar este legitim să numim folosirea unui instrument de lucru gata pentru un obiect nou o invenție? Pe de o parte, există un motiv pentru aceasta; Editarea genomului animalelor superioare este primul lucru pe care fiecare om de știință sau persoană neînvățată o gândește imediat ce înțelege ce poate face CRISPR-Cas. Pe de altă parte, jurnalistul științific John Cohen (știință, 30/30/2018) nu fără răutate vă întreabă: ce, acum, în SUA, puteți începe să lucrați la o invenție pe care doriți să o bredească, doar fără garanții de succes?

În orice caz, așa cum a scris O.V recent.Revinsky în "Chimie și viață" (nr. 6, 2018), brevetarea descoperirilor și invențiilor este o sarcină dificilă. O descriere prea generală nu vă permite să lăsați pentru dvs. evoluții concrete concrete, prea detaliate le va oferi unui concurent posibilitatea de a schimba numărul de piulițe de fixare și de a aplica propria dvs. invenție, care nu este identică cu cea a dvs. Editarea genomului de mamifere cu CRISPR este o mină de aur (atunci când această editare poate fi corect gestionată), cu toate acestea, este puțin probabil ca cineva să poată brevet "întregul CRISPR". Există și alte aplicații care sunt la fel de importante.

Editare minimală

Chiar și non-biologii știu acum totul despre clasicul CRISPR-Cas. Oricine dorește să editeze o anumită secțiune a ADN-ului sintetizează hidro-ARN complementar. HydRNA fixează pe acest loc nucleaza nucleară, care taie ADN, cel mai adesea Cas9. După tăierea ADN-ului, ele se lipesc împreună, introducând secțiunea corectă în loc de mecanismele proprii de reparații celulare excizate. Problema este că eficiența acestui sistem este încă departe de 100%, ceea ce limitează foarte mult aplicațiile medicale, de exemplu, corectarea mutațiilor dăunătoare.Dezactivarea genelor folosind CRISPR este bună, și este foarte plăcut să experimentăm, dar aș dori să merg mai departe.

O nouă modalitate de a edita ADN sau ARN: corecția se face doar în baza azotului, ca rezultat, o nucleotidă este înlocuită de o altă nucleu fără a tăia lanțul

În octombrie 2017, aproape simultan, două articole au fost publicate online la știință și natură – aproximativ două noi modificări ale metodei CRISPR-Cas9. Primul este pentru editarea ADN-ului (natură, 2017, V. 551, p. 464-471), al doilea este ARN (știință, 2017, eaaq0180). Spre deosebire de metoda clasică, acestea nu implică tăierea acidului nucleic, nu se descompune lanțul deoxiribifosfat (sau lanțul fosfat de riboză, în cazul ARN), dar se corectează baza azotată. O scrisoare a codului genetic se transformă într-un altul, fără a-și părăsi locul.

Șeful primei lucrări este David Liu de la Universitatea Harvard (atât el, cât și coautorii săi sunt afiliați la Institutul Brod, acest Institut angajat în cercetarea biomedicală și genetică are un parteneriat cu Harvard și Institutul de Tehnologie din Massachusetts). Ei au folosit "mort" (mort) Cas9, sau dCas9, care nu își tăie ambele fire, ca de obicei, ci doar stă pe o anumită secțiune.Modificarea este făcută de o altă enzimă – transformă adenina bazică azotată (Aa) inozină eu. scrisori eu nu există ADN, iar mecanismele celulare pentru reparația sau copierea ADN-ului sunt transmise eu pe G – guanină. Ca rezultat, o pereche de nucleotide AT înlocuit cu GC.

Literele din ADN au fost corectate înainte: în 2016, Liu și coautorii săi au publicat un articol despre instrumentul de înlocuire a citozinei C pe timină T (adică cupluri CG pe TA). Ambele sunt importante: cauza multor boli ereditare este doar substituții cu un singur nucleotid în genom. Desigur, nu toată lumea, ci călătoria a o mie de ori începe cu un pas. "Ar fi atât de scurt-vedere din punct de vedere științific, și ar fi strategic incorect să concluzionăm că bazele de editare poate fi cel mai bun mod pentru ca o persoană să se supună terapiei genice", a spus Liu.

Și Feng Zhang și co-autori au creat un instrument pentru editarea ARN-ului. Principiul este același, nucleaza "moartă" este diferită – dCas13, ARN este de asemenea corectată A pe eu, dar deoarece în timpul sintezei proteinei pe matricea ARN, inozina este citită ca guanină, atunci nimic nu poate fi schimbat. Autorii i-au numit sistemul Modificarea RNA pentru înlocuirea programabilă de la A la I (REPAIR).Ei sugerează că editarea moleculelor de matrice scurtă de viață și a ARN-ului de reglementare poate fi o metodă terapeutică mai sigură decât editarea ADN-ului. Și judecând prin prezentările de pe site, compania nou înființată Beam Therapeutics, printre co-fondatorii cărora David Liu și Feng Zhang se bazează pe editarea nucleotidelor unice.

Rețineți că laboratorul Dudna se ocupă și de editarea bazelor azotate.

"Un piept de comori în care continuăm să săpăm …"

La editare, lumina nu s-a unit, CRISPR poate fi folosit în multe alte moduri. În februarie 2018, o echipă de cercetare condusă de Feng Zhang a introdus fâșii de test pe hârtie pentru a determina agentul cauzal al bolii sau pentru a face genotipări în afara laboratorului.

Sistemul de testare se numește SHERLOCK (Specific de înaltă sensibilitate Enzymatic Reporter Unlocking). Se pare surprinzător de simplu, ca un test de sarcină, o bandă de hârtie care poate fi îmbibată într-un fluid biologic și poate vedea una sau două linii purpurii pe ea; două pot însemna, de exemplu, prezența unui virus periculos. Sistemul este compatibil atât cu ADN cât și cu ARN.

Benzi de testare SHERLOCK bazate pe tehnologia CRISPR. De la stânga la dreapta: două neutilizate, trei negative. Foto: Laboratorul Zhang, Institutul general al MIT și Harvard

De fapt, echipa a lansat prima serie de Sherlock în aprilie 2017: sistemul de testare a determinat tulpinile de virusuri Zika și dengue, distins bacterii patogene, mutații identificate în ADN-ul tumorii. Noua versiune a SHERLOCKv2 a crescut semnificativ sensibilitatea, a devenit posibilă cuantificarea și identificarea simultană a mai multor molecule – precum și o nouă formă a testului, aceeași bandă de strip în loc de detectare fluorescentă. Este ușor de imaginat că astfel de dungi vor găsi o aplicare largă în agricultură și în producția biotehnologică.

Cea mai importantă componentă a SHERLOCK este proteina Cas13 asociată cu CRISPR. Dezavantajul său este considerat a fi activitate nespecifică: spre deosebire de Cas9 normal, poate să taie nu numai molecula țintă, ci și alte molecule de acid nucleic aflate în apropiere. Pentru editarea genomului, acest lucru, desigur, nu este bun. Dar pentru diagnosticare – doar corect. Un construct care găsește secvența de interes pentru acidul nucleic (genomul unui virus, o mutație în genomul celulei) și când o găsește, efectuează o reacție clară – acesta este visul de cristal al specialiștilor în diagnosticarea moleculară!

Creatorii SHERLOCK hrănesc complexul CRISPR-Cas13 cu ARN special sintetizat, cu o moleculă reporter fluorescentă la un capăt și cu un inhibitor (o moleculă care stinge fluorescența) la cealaltă. Cas13 scindează mai întâi molecula țintă, apoi ARN-ul semnalului și, pe măsură ce se îndepărtează de stopatorul, reporterul începe să fluoresce.

Pentru a detecta mai multe canale ADN sau ARN într-o singură probă, de exemplu, doi viruși cu semnal fluorescent separat pentru fiecare, autorii au luat diferite enzime similare cu activitatea pe Cas13 de la diferite bacterii și au ales pe cele care preferă să taie anumite secvențe nucleotidice în reporteri.

Cum se fac benzi de test SHERLOCK. Dacă în probă este prezentă o moleculă țintă, CRISPR-Cas13 o scindează și, în același timp, reporterul ARN. La un capăt al colorantului reporter FAM (fluoresceinamidită), iar la celălalt în loc de stingător – biotină. Atunci când soluția se ridică de-a lungul unei benzi, FAM interacționează cu anticorpi care transportă nanoparticule de aur, apoi jumătăți de molecule reporter și / sau "biotin" ale celor despicate se leagă în zona streptavidinei, iar jumătățile cu FAM și anticorpii formează a doua bandă

Cu ajutorul unor trucuri speciale, dezvoltatorii au reușit să ridice sensibilitatea la 2 am (attomol – 10−18 mol!). Aceasta nu este o reasigurare, pentru multe sarcini practice este necesară o astfel de sensibilitate. Apropo, autorii nu uita de terapia genica – ei cred ca SHERLOCK va ajuta la identificarea mutatiilor inainte de a proceda la aceasta (si dupa aceasta) si au efectuat deja o serie de experimente asupra celulelor umane in vitro. În aprilie, au propus o nouă modificare a protocolului numit HUDSON (Încălzirea neextracționată a probelor de diagnostic pentru a elimina nucleele) – îmbunătățit SHERLOCK, care dă rezultatul în mai puțin de două ore.

Un principiu similar de funcționare pentru sistemul de testare DETECTR (ADN-ul endonucleazei ADN țintă CRISPR Trans Reporter), stabilit la Institutul Medical Howard Hughes sub îndrumarea lui Jennifer Dudna. Un articol despre el a fost publicat pentru prima data bioRxiv.org în noiembrie 2017, iar pe 15 februarie 2018 a ieșit știință (observați cum ambele echipe merg la culoare). Dudna și colegii au luat-o pe Cas12a, una dintre enzimele pe care Zhang și coautorii le-au folosit pentru sistemul lor multi-canal. Autorii DETECTR au atins de asemenea sensibilitatea atololar.

Principiul funcționării sistemelor de testare bazate pe CRISPR. Pentru ei, în loc de Cas9 tradițional, se utilizează nucleaze cu acțiune nespecifică – ele împărțesc nu numai molecula țintă, ci și moleculele de semnalizare cu o moleculă fluorescentă la un capăt și o atenuare a stingerii la cealaltă.Când molecula fluorescentă este îndepărtată din dispozitivul de stingere, eșantionul se aprinde

Ei au testat metoda cu Dr. Joel Palefsky și echipa sa de la Universitatea din California, San Francisco. Papilomavirusurile oncogene care au cauzat cancer de col uterin, HPV 16 și 18, au fost identificate în eșantioane și au fost distinse destul de bine. Exact, simplu și ieftin (costul unui test este mai mic de un dolar), metoda de detectare a unor astfel de viruși importanți va fi cu siguranță o cerere. Și din nou, ar exista un sistem de testare și ce să măsoare – există.

Nu e de mirare că Dudna și colegii au lansat o pornire de diagnosticare. echipă Mammoth Biosciencesprintre co-fondatori, trei autori ai unui articol despre DETECTR, inclusiv Jennifer Dudna, la sfârșitul lunii aprilie 2018, au anunțat planuri ambițioase: să efectueze teste pentru detectarea multor biomarkeri ADN sau ARN în același timp, în ambulatoriu sau în condiții de locuință. Pentru a face acest lucru, va fi suficient să cumpărați un card de testare de dimensiunea unui card de credit. Dacă un client dorește să facă acest lucru la domiciliu, acesta va fi rugat să fotografieze rezultatul, într-un mod sigur, să încarce fotografia pe site-ul companiei: va primi un răspuns confidențial și o recomandare medicală în decurs de o oră.Va fi posibil, de exemplu, să determinați dacă o persoană este bolnavă de gripă și, dacă da, cu ce tulpină specială este infectată. Aplicațiile nonmedicale sunt, de asemenea, planificate: în agricultură, știința solului și chiar în industrie, de exemplu, în căutarea microorganismelor corozive. După cum spune Lucas Harrington, un student absolvent la laboratorul lui Dudna, CRISPR, "este un piept de comori în care continuăm să ne grăbim, găsind lucruri noi".

Cel mai probabil, sistemele de testare de la mamut va fi bazat pe DETECTR, dar detaliile tehnologiei rămân secrete: este doar cunoscut faptul că compania a obținut o licență exclusivă de la Universitatea din California.

Unii comentatori se îndoiau dacă această pornire ar cauza noi litigii în materie de brevete. Faptul este că Zhang a patentat proteina Cas12a în 2015, iar licența pentru aceasta aparține companiei Editas Medicine. Cu toate acestea, acest brevet se ocupa de editarea genei și nu de diagnosticare. Poate că titanii CRISPR vor putea în cele din urmă să separe sferele de influență.

Acest articol nu spune aproape nimic despre posibilele utilizări agricole. Titanii CRISPR se angajează cu entuziasm în aplicațiile practice ale tehnologiei și, apropo, în descoperirea "imunității bacteriene" în sine, cererea societății Danisco de iaurt, care dorea să-și protejeze culturile de viruși, a jucat un rol semnificativ.Jennifer Dudna, de exemplu, supraveghează cercetarea genomului de cacao la Institutul de Genomică Inovatoare (Berkeley) pentru a crea soiuri care pot tolera încălzirea globală. Bineînțeles, fără ciocolată, nici o încălzire pentru omenire nu va fi o bucurie! Acest subiect este sponsorizat de compania "Marte". Și dacă vă amintiți că plantele produse folosind tehnologia CRISPR nu pot fi considerate OMG, cel puțin în Europa acest lucru este în discuție (natură, 01/19/2018), – va deveni evident că "pieptul de comori" nu va arăta în curând fundul.


Like this post? Please share to your friends:
Lasă un răspuns

;-) :| :x :twisted: :smile: :shock: :sad: :roll: :razz: :oops: :o :mrgreen: :lol: :idea: :grin: :evil: :cry: :cool: :arrow: :???: :?: :!: