ADN-ul este blocat

ADN-ul este blocat

Svetlana Khodyreva, Anastasia Kosova și Olga Lavrik
"Science first hand" №5 / 6 (53/54), 2013

Etapa finală a reparării ADN-ului uman, în care este implicată enzima ADN ligază I. Figura de T. Ellenberger și D. Gohar (Universitatea din Washington, St Louis, SUA)

ADN-ul este una dintre principalele bogății ale unei celule vii, asigurându-i funcționarea neîntreruptă. "Reparația" (reparația) daunelor generate în mod constant ale moleculelor ADN se face prin sisteme speciale de reparare intracelulară în care "funcționează" ansambluri de enzime proteice speciale. Cu toate acestea, la fiecare punct din celule există zeci de mii de daune ADN diferite, dintre care unul este adesea suficient pentru moartea celulelor.

Cu toate acestea, în cazul tumorilor maligne, sistemele reușite de reparații pentru repararea leziunilor ADN cauzate de terapia anti-cancer pot nega eforturile medicilor. Cercetătorii sibieni au dezvoltat o nouă metodă de detectare a antigenului Ku, o proteină cheie în sistemul de "reparare" a spărturilor de ADN dublu catenar cauzate de radioterapie în celulele canceroase ale tumorilor. Astfel de studii ale mecanismelor de reparare a ADN nu sunt doar fundamentale, ci și de mare importanță practică.

Despre autorii

Svetlana Nikolaevna Khodyreva – Doctor în științe biologice, cercetător de frunte, Laboratorul de Chimie Enzime Bioorganice, Institutul de Biologie Chimică și Medicină Fundamentală, Filiala Siberiană, Academia Rusă de Științe (Novosibirsk). Autor și coautor al a 107 lucrări științifice și 3 brevete.

Anastasia Andreevna Kosova – Student postuniversitar al laboratorului de chimie bioorganică a enzimelor IHBiFM SB RAS (Novosibirsk). Laureat al premiului Președintelui pentru sprijinirea tineretului talentat (2006-2008). Autor al unei publicații științifice.

Olga Ivanovna Lavrik – Membru corespondent al Academiei de Științe din Rusia, Profesor, Doctor în Științe Chimice, Șeful Laboratorului de Chimie Enzimatică Bioorganică al Institutului de Biologie Chimică și Medicină Fundamentală, Filiala Siberiană a Academiei de Științe din Rusia (Novosibirsk). Câștigător al Premiului de Stat al URSS (1984). Autor și coautor al a peste 330 de lucrări științifice, inclusiv 11 monografii și manuale, precum și 4 brevete.

ADN-ul este depozitul principal al informațiilor genetice ale organismelor vii afectate în mod constant de diferiți factori de natură chimică și fizică, cum ar fi radicalii liberi, radiațiile ultraviolete etc. Ca rezultat, ADN-ul este deteriorat: apare pierderea și oxidarea bazelor azotate, pauze.

Cele mai periculoase daune sunt pauzele duble. Deoarece ADN-ul este o helix constituită din două lanțuri complementare de nucleotide, rupturile care apar într-una din lanțuri, de regulă, nu duc la consecințe catastrofale pentru celulă: al doilea lanț conține toate informațiile necesare pentru a restabili complet daunele. Totuși, chiar și un singur decalaj dublu-catenar poate duce la moartea celulară, iar "reparația" necorespunzătoare a unor asemenea daune poate provoca o mutație sau o pierdere a informațiilor genetice. Atunci când mai multe astfel de leziuni apar simultan la o distanță scurtă una de cealaltă, ADN-ul se destramă literalmente.

Alte daune ale ADN-ului pot fi, de asemenea, periculoase pentru viața celulelor dacă sunt situate lângă ușă. Acest lucru se datorează faptului că procesul de reparare a celor mai multe daune implică în mod necesar etapa de rupere a lanțului.

Printre toate daunele cauzate moleculei ADN, pauzele cu două catenuri sunt cele mai periculoase pentru celule, precum și distrugerea clusterului dintr-o combinație de situsuri AP, baze oxidate și pauze în decurs de 1-2 rotații ale helixului ADN.Astfel de daune apar de obicei sub acțiunea radiațiilor ionizante și a medicamentelor radiomimetice.

Formarea unor astfel de grupări (grupa) dauna este caracteristică acțiunii radiațiilor ionizante – de aceea este folosită pentru a distruge celulele canceroase. Diferitele tipuri de radioterapie diferă în ceea ce privește gradul de perturbații ale structurii ADN pe care le produc și spectrele daunelor rezultate, în timp ce cele mai sensibile la acțiunea radiațiilor ionizante sunt celulele tumorale care se divizează mai activ decât cele sănătoase.

Cu toate acestea, o astfel de terapie împotriva cancerului este departe de a fi întotdeauna eficientă, ceea ce se explică adesea prin activitatea crescută a proteinelor celulare care "repară" pauzele dublu-catenare. Și în acest sens, de mare interes practic sunt metodele prin care ar fi posibilă reducerea activității mașinilor "reparative" celulare și, astfel, să contribuie la distrugerea celulelor tumorilor maligne.

Dar pentru o gestionare eficientă a sistemului reparații ("repararea" ADN-ului) este necesar să existe informații exacte despre toate proteinele implicate în "repararea" ADN-ului, inclusiv raportul lor cantitativ în celulă,precum și munca lor "în combinație", și anume participarea la alte procese celulare. Aceasta din urmă este extrem de importantă deoarece poate provoca un rău iremediabil organismului în ansamblul său, suprimând sistemele celulare de reparare a ADN-ului.

Cele de mai sus se aplică în întregime "eroului" povestirii noastre – Antigenul Ku, o veveriță cu multe talente și o soartă complexă.

Repararea ADN-ului

Pentru a înțelege funcția și rolul antigenului Ku, mai întâi trebuie să vă familiarizați cu cele două mecanisme principale pentru repararea pauzelor de ADN dublu catenar: o recombinare omoloagă și un compus non-homolog.

Prima modalitate este "reparația" pauzelor dublu catenare care apar într-o celulă divizată activ pe acele faze ale ciclului celular, când s-au sintetizat deja copii ale moleculei ADN. Aceste copii sunt utilizate ca matrice pentru re-sinteza ADN-ului la locul de deteriorare. Acest proces, efectuat de un ansamblu special de proteine, are loc fără pierderea sau denaturarea informațiilor genetice, datorită prezenței moleculelor de ADN intacte care sunt identice cu cele originale.

La alte faze ale ciclului celular, repararea ADN-ului urmărește calea unei legături ne-omoloage a capetelor cu participarea unui ansamblu de proteine, în care antigenul Ku joacă prima vioară (Davis et al., 2013).Acest mod de reparare este mai puțin precis, dar, paradoxal, este cel care predomină în celulele organismelor eucariote superioare, care includ oamenii.

Proteina antigenului Ku joacă un rol important în repararea spărturilor de ADN dublu catenar de-a lungul căii unei legături ne-omoloage a capetelor. Este prezentă în toate tipurile de organisme vii, de la bacterii la plante și animale. În eucariote (organisme cu nucleu celular stabilit), antigenul Ku constă din două catene sau subunități polipeptidice – Ku80 și Ku70 (numerele din nume reflectă greutatea lor moleculară aproximativă în kilodalți). Subunitățile sunt conectate una la cealaltă și formează împreună o structură cu o gaură în interior, asemănătoare unei blocări "agățate" cu un corp masiv și un mâner subțire sau un coș de răchită cu mâner. Prin: (Walker et al., 2001)

Antigenul Ku este implicat în prima etapă a procesului de reparare: "recunoaște" capetele pauzelor dublu-catenare, le aduce împreună și le menține până la restabilirea structurii originale a ADN-ului. Structura antigenului Ku în sine este perfect potrivită pentru o astfel de activitate: seamănă cu o încuietoare "agățată" cu un corp masiv și un mâner subțire sau un coș de răchită cu mâner (Walker et al., 2001).Două molecule de antigen Ku, "uzate" la capetele moleculei ADN, interacționează între ele ca cele două jumătăți ale unei agrafe magnetice care ține în siguranță un șir de margele în jurul gâtului.

Metoda de legare a antigenului Ku cu ADN-ul precum "bilele pe șir" permite proteinei să alunece liber de-a lungul ADN-ului, ceea ce este necesar pentru funcționarea complexului de reparare a proteinelor. Stivuirea sub formă de coș a subunităților Ku-antigen deschide accesul relativ liber al altor proteine ​​de reparare la ADN-ul din zona "mâner"; "Corpul" coșului servește ca o platformă pe care are loc asamblarea proteinelor de reparare în jurul pagubelor.

Procesul de reparare ("reparație") a spărturilor de ADN dublu catenar care implică antigenul Ku are loc în mai multe etape. În primul rând, antigenul Ku "recunoaște" capetele unei molecule de ADN rupt și le aduce mai aproape. Atunci când o proteină interacționează cu o moleculă de ADN, ea este "strungă" pe ea ca o margine pe un șnur. Apoi, enzimele speciale "au curățat" capetele ADN-ului, iar alte enzime umple gap-ul din secvența de nucleotide și "coase" -l. Astfel, integritatea originală a moleculei ADN este restabilită. În plus față de antigenul Ku, ansamblul proteinelor de reparare include nucleaze specializate pentru tăierea capetelor ADN-ului,ADN-polimeraze pentru resinteza situsurilor ADN-ului, precum și a ligazei ADN-ului, asigurând restaurarea integrității coloanei vertebrale de glucoză-fosfat a ADN-ului. Antigenul Ku însuși "funcționează" ca parte a proteinei kinazei dependentă de enzima ADN cuplată la subunitatea catalitică

Abordare universală

Cu toate acestea, valoarea antigenului Ku pentru organism nu este deloc limitată la participarea sa la procesul de reparare a ADN-ului. Prin urmare, nu este surprinzător faptul că această proteină a fost descoperită de mai multe ori în studiul diferitelor procese.

Pentru prima dată, antigenul Ku a fost detectat la pacienții cu boli autoimune (polimiozită, sclerodermie, lupus eritematos sistemic) ca o proteină antigen care cauzează producerea de anticorpi. Acesta a fost numit după primele litere ale numelui pacientului, pentru care s-au găsit astfel de anticorpi. Ulterior, anticorpii la antigenul Ku au fost de asemenea găsiți la pacienții cu alte boli autoimune, în special artrita reumatoidă.

În primul rând, sa constatat că antigenul Ku este predominant în nucleele celulelor, apoi a fost descoperită capacitatea acestuia de a interacționa cu ADN-ul. A fost nevoie de câțiva ani pentru a stabili faptul că această proteină este implicată în repararea pauzelor de ADN dublu catenar.După această descoperire, informațiile despre rolul antigenului Ku în diverse procese celulare au căzut ca un corn de abundență.

Trebuie remarcat faptul că în unele cazuri acest rol este determinat direct de participarea sa la procesul de reparare a ADN-ului. Acesta este un proces fiziologic unic, care apare în stadiile incipiente de dezvoltare a celulelor sistemului imunitar și asigură organismului așa-numita imunitatea celulară congenitală.

Faptul este că partea din gena care codifică partea variabilă a anticorpilor (sau receptorilor) responsabili de recunoașterea antigenului în precursorii celulelor sistemului imunitar constă din mai multe segmente ADN repetitive aparținând a trei clase – V, D și J. În timpul diferențierii celulelor imune prin proces V(D)J– recombinarea formează o populație de celule conținând diverse combinații V, D- și J-(unul din fiecare clasă), care asigură capacitatea acestor celule de a recunoaște diferite antigene. Aceste evenimente, care formează diversitatea primară a anticorpilor (receptorilor), apar cu mult înainte ca organismul să se "cunoască" cu bacterii, viruși și alți agenți patogeni reali.Deoarece recombinarea implică formarea de pauze dublu catenare în ADN, antigenul Ku asigură reparația lor. În consecință, funcționarea defectuoasă a acestei proteine ​​conduce la o imunodeficiență combinată severă.

Prin urmare, folosind aceeași "mașină", ​​natura înțeleaptă rezolvă sarcinile aparent complet independente.

Lucrător cu fracțiune de normă

Pe lângă activitățile legate direct de repararea spărturilor de ADN dublu catenar, antigenul Ku este de asemenea implicat în procesele celulare, într-un fel sau altul legat de menținerea structurii ADN.

De exemplu, o scădere a cantității sale într-o celulă afectează negativ procesul. replică, adică, sinteza moleculei ADN fiice; această proteină contribuie, de asemenea, la plierea cromatinei în nucleu sub formă de bucle. Interesant este faptul că, deși în aceste două cazuri nu apare spargerea ADN-ului dublu-catenar, ele se caracterizează printr-o ușoară "topire" (formarea secțiunilor nepereche) a helixului dublu.

Antigenul Ku este, de asemenea, implicat în menținerea integrității. telomerilor – secțiuni de capăt ale cromozomilor, având o structură specială de secvențe repetate și protejate de proteine ​​speciale.Pe de o parte, telomerele împiedică "recunoașterea" capetelor cromozomului ca o pauză dublu-catenară care este supusă reparării. Pe de altă parte, în celulele normale, în timpul fiecărei diviziuni, telomerii sunt scurtați. În acest sens, ele servesc ca un fel de ceas, măsurând timpul de viață alocat celulei. Cu toate acestea, în celulele canceroase, lungimea telomeres rămâne constantă, iar aceste celule nu își pierd capacitatea de a diviza.

Aceste exemple demonstrează rolul antigenului Ku în conservarea și implementarea informațiilor genetice, dar aceste abilități ale unei proteine ​​uimitoare nu sunt epuizate. Deci, în mod neașteptat, sa constatat că antigenul Ku poate fi prezent nu numai în nucleu, ci și în citoplasma celulei, unde funcționează independent de ADN.

După cum se știe, antigenul Ku constă din două subunități separate. Subunitatea Ku70 din citoplasmă este implicată în răspunsul celular la efectele toxice, mai precis, în reglementare apoptoza, moartea celulară programată genetic care apare în caz de deteriorare.

Acționează în acest caz Ku70 poate în două moduri. Pe de o parte, se poate lega proteina citoplasmatică Bax, care este implicată în calea apoptotică mitocondrială.Declanșatorul pentru auto-distrugerea celulei în acest caz este mișcarea lui Bax în mitocondrii, iar Ku70, prin blocarea acestei proteine, previne apoptoza.

Pe de alta parte, Ku70 este capabil sa indeparteze din Bax moleculele de ubiquitin atasate de ea, o mica proteina celulara care serveste ca un marker de moarte pentru molecula de proteine. Astfel, Ku70 prelungește viața moleculei Bax "condamnat", ajutând la declanșarea apoptozei.

Trebuie remarcat faptul că multe celule canceroase au capacitatea de a "scăpa" de programul de auto-distrugere, ceea ce indică necesitatea de a acorda o atenție deosebită activității antigenului Ku în celulele tumorale.

Dar, toate surprizele proteinei noastre nu se termină aici. Sa constatat că antigenul Ku poate fi prezent pe suprafața exterioară a celulei, unde se leagă de membrana sa citoplasmică. În mod surprinzător, el joacă rolul "coloanei a cincea", ajutând unele bacterii și viruși să intre în celulă (Martinez et al., 2005, Munakata et al., 2005).

În plus, antigenul Ku este responsabil pentru "lipirea" celulelor între ele și a matricei intercelulare, un set de proteine ​​extracelulare care susțin structura țesutului biologic (Muller et al., 2005).De asemenea, antigenul Ku, localizat pe partea exterioară a membranei, participă la migrația celulară, ajutând o protează specială (o enzimă care descompune proteinele) pentru a "rupe" calea celulară, distrugând parțial matricea intercelulară (Muller et al., 2005). Și acest "talent" al antigenului Ku poate servi organismului în caz de cancer, contribuind la răspândirea metastazelor.

Totul este bun cu moderatie

Având în vedere varietatea funcțiilor Ku-antigen, se poate susține că atât nivelurile ridicate, cât și cele scăzute ale acestei proteine ​​pot fi un factor semnificativ care afectează funcționarea celulelor canceroase.

De exemplu, celulele unuia dintre tipurile de tumori – mielom multiplu, în loc de subunitatea normală Ku80 conțin o concentrație ridicată a unei versiuni prescurtate – Ku80v. O astfel de polipeptidă este capabilă să interacționeze în mod normal cu cea de-a doua subunitate (Ku70) și dimerul rezultat – cu capetele dublu-catenare ale ADN-ului. Cu toate acestea, o astfel de formă "defectuoasă" a antigenului Ku nu poate lega subunitatea catalitică a protein kinazei dependente de ADN, ceea ce conduce la blocarea etapelor inițiale de reparare a pauzelor de ADN dublu catenar.

Dimpotrivă, în celulele unei alte tumori – leucemia limfoidă cronică a celulelor B, conținutul formei normale a antigenului Ku este crescut, ceea ce duce la o creștere a proceselor de reparare a ADN-ului.Ca urmare, rezistența acestor celule canceroase la radiațiile ionizante și la alți agenți genotoxici este crescută, iar terapia antitumorală devine ineficientă.

Aceste exemple arată în mod convingător necesitatea determinării precise a stării antigenului Ku în celule. Pentru aceasta astăzi există mai multe abordări.

După cum știți, pentru a determina nivelul expresieadică transformarea informațiilor genetice ale unei gene într-un produs funcțional – ARN sau proteină, este cel mai adesea utilizat în practica clinică și laboratoarele de cercetare reacția în lanț a polimerazei (PCR) în timp real. Ideea ei este de a izola ARN-ul mesager de la celule, în care sunt scrise instrucțiuni pentru sinteza unei proteine ​​specifice. Acesta din urmă este apoi utilizat ca matrice pentru sinteza "inversă" a secvenței ADN corespunzătoare. ADN-ul rezultat poate fi copiat de mai multe ori.

Oamenii de stiinta au inventat si implementat cateva optiuni ingenioase pentru astfel de "reproducere" a ADN-ului, cu toate acestea, chiar si metoda cea mai sofisticata permite doar judecarea prezentei sau absentei secventei ADN dorite (si, prin urmare, a proteinei corespunzatoare) in materialul analizat.Este destul de dificil să se estimeze cantitatea de proteină activă din celulă în acest fel. În plus, prin utilizarea PCR, este imposibil să se stabilească prezența unei forme scurte de Ku80v, deoarece este inițial sintetizată folosind același șablon ARN ca cel normal și numai fragmentul "extra" este separat.

În plus față de PCR, varietățile sunt utilizate pe scară largă pentru determinarea nivelurilor de proteine. test imunologic enzimaticcare se bazează pe utilizarea anticorpilor care interacționează în mod specific cu o porțiune specifică a proteinei țintă. Acest lucru necesită două tipuri de anticorpi: primar și secundar.

Animalele de laborator (cel mai adesea iepurii sau șoarecii) sunt utilizați pentru a obține anticorpi primari, care acumulează anticorpii corespunzători și pe proteina străină introdusă de aceștia. Cu ajutorul unui alt tip de animal, se obțin anticorpi secundari ai căror sarcină este recunoașterea primelor. O enzimă este adăugată la astfel de anticorpi secundari, care este capabilă să scindeze un anumit substrat cu eliberarea unui produs luminiscent.

Atunci când testul imunologic enzimatic "in vitro" are loc un lanț de interacțiuni "proteină țintă – anticorp primar – anticorp secundar".Rezultatul este o luminiscență, prin prezența căreia proteina este detectată.

Detectarea proteinei ELISA se bazează pe utilizarea anticorpilor specifici. În acest caz, anticorpul primar interacționează în mod specific cu o porțiune specifică a proteinei țintă, iar anticorpul secundar se leagă la o porțiune specifică a anticorpului primar. O enzimă este adăugată anticorpului secundar (cel mai adesea peroxidază de hrean sau fosfatază alcalină), care, prin interacțiunea anticorpilor, scindează un substrat special pentru a forma un produs luminiscent. Prin nivelul luminiscenței poate fi detectată proteina țintă

Deoarece anticorpii interacționează cu o regiune de proteină specifică, această metodă permite să se facă distincția între subunitățile Ku80 cu lungimea diferită. Pentru a face acest lucru, trebuie să utilizați două tipuri de anticorpi primari, dintre care unul se va lega la situsul prezent în ambele variante ale polipeptidei, iar celălalt – numai în dimensiune completă.

La locul de muncă

Toate metodele de mai sus permit detectarea antigenului Ku fie indirect (în cazul PCR), fie izolat de funcțiile sale celulare. Prin urmare, în laboratorul de chimie bioorganică a enzimelor Institutului de Biologie Chimică și FundamentaleFiliala Siberiană a Academiei de Științe din Rusia (Novosibirsk) a dezvoltat o metodă fundamentală diferită pentru detectarea dreptului de antigen Ku în "locul de muncă" al acestuia pe o moleculă de ADN (Ilina et al., 2010).

Metoda se bazează pe capacitatea antigenului Ku de a interacționa cu Site-uri APadică segmente ADN în care au fost pierdute bazele azotate. Aceste "lacune" din "textul" ADN-ului sunt printre cele mai frecvente dintre pagubele sale. Antigenul Ku se poate lega de ADN-ul care conține situsuri AP, împiedicând divizarea acestor situsuri (Ilina et al., 2008). Dacă există un decalaj dublu-catenar la o distanță scurtă față de locurile de AP, atunci antigenul Ku le împarte, participând astfel la "maturarea" capetelor decalajului și pregătindu-l pentru "reparare" (Roberts et al., 2010).

O metodă pentru determinarea antigenului Ku dezvoltat de cercetătorii din Novosibirsk implică utilizarea unei probe de ADN care conține un sit AP și echipată cu o etichetă radioactivă sau fluorescentă. Prin legarea la astfel de ADN, antigenul Ku formează un complex covalent instabil cu acesta. După tratamentul special al unui astfel de complex, antigenul Ku este ireversibil "cusut" cu ADN, care în acest caz joacă rolul de "etichetă". Datorită etichetei de pe sonda ADN, este posibil să se înregistreze fiabil și cu o sensibilitate ridicată produsele rezultate și chiar să se determine cantitatea acestora.

Baza metodei de detectare a antigenului Ku dezvoltată la IHBFM SB RAS este capacitatea acestei proteine ​​de a interacționa cu ADN-ul care conține un situs AP (baza de azot pierdută). O astfel de probă ADN conține de asemenea o etichetă radioactivă sau fluorescentă. Proteina formează un complex covalent instabil cu ADN, mediată de formarea unei baze Schiff între gruparea amino primară a proteinei și situsul AP. Acest complex poate fi restabilit cu borohidrură de sodiu, ca urmare a faptului că se formează o "reticulare" ireversibilă a ADN-ului proteic. Eticheta de pe sonda ADN permite detectarea antigenului Ku-țintă al proteinei țintă

Principalul avantaj al acestei abordări este acela că determină toate formele active ale antigenului Ku capabil să se lege la ADN, inclusiv versiunea sa scurtă. În plus, noua metodă este mai simplă și mai ieftină decât imunotestul convențional.

Antigenul ku este o proteină cheie pentru asigurarea activității sistemului de reparare a pauzelor de ADN dublu catenar, care apar în cantități semnificative în timpul radioterapiei tumorilor: în acest sens, nivelul său poate fi considerat un factor de prognostic important în determinarea eficienței și fezabilității acestei metode de tratament.

Noua metoda de detectie a antigenului Ku propusa de cercetatorii de la Novosibirsk face posibila estimarea nivelului proteinei active in celulele canceroase si poate fi folosita in scopuri prognostice impreuna cu metoda PCR folosita pe scara larga in prezent.

Lucrarea privind studiul proprietăților antigenului Ku continuă și este legată de studierea capacității acestei proteine ​​de a interacționa nu cu singură, ci cu daune complexe în grupuri (Kosova et al., 2014). Se speră că în viitorul apropiat vom putea nu numai să învățăm multe despre funcțiile acestei proteine ​​uimitoare, ci și să folosim aceste cunoștințe în scopuri practice.

Această lucrare a fost susținută de Fundația rusă pentru cercetarea de bază (proiectul nr. 13-04-01426) și cu programul RAS "Biologie moleculară și celulară".

literatură
1. Khodyreva S. N., Lavrik O. I. Cum o celulă repara ADN-ul // Science first-hand. 2007. № 3. S. 82-89.
2. Davis A.J., Chen D.J. Repararea ADN-ului de sfârșiere a structurii ADN-ului pentru legături ne-omoloage end-end // Transl. Cancer Res. 2013. V. 2. P. 130-143.
3. Ilina E. S., Lavrik O. I., Khodyreva S.N. antigenul Ku interacționează cu siturile abazice // Biochem. Biophys. Acta. 2008. 1784. P. 1777-1785.
4. Ilina E.S., Khodyreva S.N., Berezhnoy A.E. și colab. Seturi de urmărire cu site-uri abasice // Mutat. Res. 2010. V. 685. P. 90-96.
5. Walker J.R., Corpina R.A., Goldberg J. natură. 2001. V. 412. P. 607-614.


Like this post? Please share to your friends:
Lasă un răspuns

;-) :| :x :twisted: :smile: :shock: :sad: :roll: :razz: :oops: :o :mrgreen: :lol: :idea: :grin: :evil: :cry: :cool: :arrow: :???: :?: :!: